发表期刊：Environmental Pollution
发表时间 ：2019.8.14
研究内容：奶牛场土壤呈现出不同的微生物群和不同的抗生素耐药性
影响因子：5.714
实验方法：16S rRNA基因测序
牛奶是大家都非常熟悉富含营养元素是人们生活中不可或缺的饮品。为了让大家喝到更新鲜健康的牛奶，本文作者就来探索奶牛场中不同年龄段，不同生活条件，不同抗生素使用频率的奶牛对微生物群分布和耐药性的影响。
研究综述
抗生素耐药性对公众健康构成重大威胁，家畜肠道细菌是抗生物抗药性基因（ARGs）的重要来源。虽然人们对动物的肠道微生物群和抗生素抗性了解很多，但对这些动物的近邻环境影响的了解有限。当动物接受抗生素治疗时，富含ARGs菌群的粪便脱落与排泄的抗生素一起，可在农田土壤中导致抗生素耐药菌“大量繁殖”。土壤传播的耐药细菌数量的增加增加了向动物传播和定植的可能性。确定农场上可预测的热点问题有助于确定有针对性的策略，以限制抗生素耐药菌在食品环境中的持续存在。
研究方法
作者从7个非相邻的商业奶牛场采集42份粪便和84份土壤样本，包括断奶前犊牛（<7-8周）、断奶后小母牛（<13-15个月）、产后母牛、泌乳母牛、非泌乳母牛和隔离用于各种治疗的母牛。所有的样本都被立即冰上保存并运送到实验室进行DNA提取，用分光光度计分析评估DNA提取液的质量和浓度，然后520F和802R引物扩增16srDNA基因V4区，制备16srDNA文库；最后利用Illumina MiSeq（250bp PE）平台进行测序。并结合ARGs丰度的测定，药敏试验，滤膜接合法质粒接合转移实验，脉冲场凝胶电泳(PFGE)，并合理通过差异算法得到最后统计结果。
研究结果
图1. 奶牛的粪便微生物群（a） Shannon多样性指数测定α多样性的盒形图，不同的字母表示有统计学意义的组（下同）。由图可得，医院圈饲养的奶牛的微生物群差异最小。（b） 基于Bray-Curtis矩阵的乳制品粪便样品的三维NMDS。图中可以看小牛与医院圈牛、泌乳牛和非泌乳母牛有较大区别，而泌乳牛和非泌乳母牛的粪便微生物群也不同（c） 描述细菌科水平相对丰度随时间变化的堆叠图；相对丰度小于1%的细菌家族被归为“其他”。瘤胃球菌科的检出率最高（相对丰度约为12.7%），其次是假单胞菌科（约为11.8%）、莫拉克素科（约为11.3%）、漆螺科（约为6.0%）和类杆菌科（约为5.5%）。图2. 不同区域的土壤中微生物类群相比之下，不同居住区域之间土壤的α多样性没有显著差异，但β多样性测量的土壤群落组成显示出总体差异；棒状杆菌科（约7.5%）和葡萄球菌科（约7.4%）、扁平球菌科（约6.5%）、肠杆菌科（约4.7%）是土壤中最丰富的微生物科，总共约占26%。图3.在不同区域，粪便样本中ARGs表达量在粪便中，32个ARGs在不同的居住区之间没有显著差异，但是来自小牛、小乳牛的粪便更容易检测出阳性（图3a）。通过排序分析测定的粪便ARGs多样性在不同动物群中表现出不同的模式，小牛的多样性显著，与其他地区饲养的动物不同（图3b）。在所有32个ARGs中，β-内酰胺类耐药基因包括CMY-2（6个区域平均检测率约38.1%）和TEM（约40.5%）、1个MLS抗性基因mefA/E（约92.9%）、2个phenicol抗性基因fexB（约52.4%）和floR（约83.3%），从六个区域的牛粪便中观察到一种四环素抗性基因tet（B）（约69%）（图3c）。值得注意的是，这是第一项研究证明了在美国存在奶牛源性的cfr、cfrB和optrA等抗性基因。图4.在不同地区，土壤样本中目标ARGs的表达量与粪便中的观察结果一致，与医院圈、哺乳圈和干栏圈相比，小牛圈中ARGs的患病率显著升高（图4a）。排序分析表明，土壤中不同居住圈的ARG多样性存在显著差异，小母牛圈和干牛圈的ARGs结构有显著差异，而小母牛圈和医院圈的ARGs结构有显著差异（P<0.05）（图4b）。在32个ARGs中，在所有住房区都有12个基因包括aac（6‘）-ib（~66.7%；氨基糖苷）、CMY-2（~21.4%；β-内酰胺）、TEM（约54.8%；β-内酰胺）、ermA（约70.2%；MLS）、ermC（约40%；MLS）、mefA/E（约85.7%；MLS）、sal（A）（约13.1%；MLS）、fexA（约41.7%；phenicol）、fexB（约67.9%；phenicol）、floR（约75%；phenicol）、tet（A）（约23.8%；四环素）和tet（B）（约65.5%；四环素），在小牛圈土壤中检测到一个氨基糖苷类抗性基因rmtC和一个磷霉素抗性基因fosA3（图4c）。图5.不同住宅区粪便和土壤样本floR绝对丰度在粪便和土壤中，六个测量区域的floR丰度差异显著。在粪便中，小牛圈和小母牛圈的floR丰度最高，尤其是小牛圈的floR含量明显高于医院圈、新鲜圈、哺乳圈和干牛圈。小牛圈粪便中的floR基因比医院圈和哺乳圈的更丰富。在土壤中，小牛圈和小母牛圈中的floR比新鲜圈和哺乳圈中的要丰富，而新鲜圈中的floR比干牛圈土壤中的要丰富得多。图6.对（a）耐头孢噻呋和（b）抗氟苯尼考大肠杆菌CFU计数由图可见，与其他居住区相比，小牛圈土壤中的抗生素抗性大肠杆菌比奶牛场的其他居住区分布更为分散。所有分离的土传头孢噻呋和氟苯尼考残留大肠杆菌都是多重耐药的，质粒介导的传播可能解释了菌株之间的传播。此外，抗生素抗性细菌可能在农场之间共享，这可能使得抗生素在乳品生产中长期存在。
研究总结
本研究表明，不同的居住区，粪便和土壤样本中的抗药性生物和抗性基因的分布有所不同，而且更年轻的动物更容易获得抗性基因。由于知道奶牛犊牛和小母牛及其相关的区域是ARGs最有可能的热点，这些地点的废物可以单独和更全面地处理（例如堆肥），以便在现场应用前减少或消除抗生素转移。参考文献Liu Jinxin,Zhao Zhe,Avillan Johannetsy J et al. Dairy farm soil presents distinct microbiota and varied prevalence of antibiotic resistance across housing areas.[J] .Environ. Pollut., 2019, 254: 113058.